白藜芦醇调控细胞自噬的病理生理学意义

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　　摘要：白藜芦醇可调控细胞自噬，对于白藜芦醇的这种活性的病理生理学意义主要见于肿瘤防治领域，其它白藜芦醇的这种自噬调控活性对心血管系统疾病和神经性疾病的治疗也有指导意义。在对肿瘤细胞的作用上，白藜芦醇调控自噬上存在2种截然不同的报道，即白藜芦醇促进自噬和抑制自噬，但主流倾向于白藜芦醇诱导和促进细胞自噬。在肿瘤细胞上，白藜芦醇也主要通过诱导自噬而产生抗肿瘤的效果，但也有抑制自噬反而加强白藜芦醇的抗肿瘤作用的报道，具体可能因肿瘤细胞种类和处理方式的不同而异，至于在肿瘤细胞上，白藜芦醇诱导自噬与凋亡的关系，也存在2种相反的报道，即激活自噬抑制凋亡和促进凋亡。本文拟就白藜芦醇调控细胞自噬的病理生理学意义进行梳理综述。

　　关键词：白藜芦醇;细胞自噬;肿瘤;凋亡
　　1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞样细胞（BCSCs）增殖和诱发细胞自噬[1]。天然多酚类化合物白藜芦醇，大量存在于植物性食物，其抗癌特性已被广泛的研究。考虑到癌症干细胞在乳腺肿瘤发生和进展中的重要作用，白藜芦醇对肿瘤干细胞的影响是值得研究。白藜芦醇显著抑制BCSCs的增殖，和减少了BCSCs的百分比，因此在非粘着球状群中，减少了乳腺球的大小和数量。因此， 给NOD / SCID小鼠（不肥胖的糖尿病/严重联合免疫缺陷）注射白藜芦醇（100毫克/公斤/天）有效地抑制移植肿瘤的生长和在肿瘤细胞减少BCSC。原发肿瘤细胞再植入二级老鼠30 d后，6个对照组都产生肿瘤，而用来源于白藜芦醇处理老鼠肿瘤细胞植入6只老鼠只有1只产生肿瘤。进一步，通过TEM（透射电子显微镜） 分析 puncta LC3-II形成，用免疫印迹分析GFP-LC3-II，Beclin1和Atg 7，表明白藜芦醇诱发BCSCs自噬。此外，白藜芦醇在BCSCs中，抑制了Wnt /β-catenin信号途径;通过转染质粒过表达的β-catenin明显减少了白藜芦醇诱导的细胞毒性和BCSCs的自噬。我们的研究结果表明， 通过抑制Wnt /β-catenin信号通路，白藜芦醇抑制BCSCs增殖并诱发细胞自噬。
　　 2 白藜芦醇引起人K562凋亡、红系分化和自噬[2]。白藜芦醇（Res）是一种天然植物抗毒素具有促白血病细胞凋亡和诱导球蛋白的作用，但它潜在的诱导红系细胞分化的作用并不完全理解。在这里，我们调查了白藜芦醇对人类红系巨核细胞白血病细胞系K562 的影响。在处理细胞中， 抑制了细胞增殖，发生了细胞凋亡和细胞死亡。通过红系细胞实验，我们发现Res可能增加了血型糖蛋白的表达（GPA），HBA1、HBB，和γ-globin基因的表达并且加强了GPA，CD71，Band3蛋白质的表达。当Res的浓度增加了50或100μM时，Res也诱导K562细胞自噬。我们的研究结果表明，Res不仅能诱导凋亡也能诱导红细胞分化和K562细胞自噬。这些结果认为Res可能是治疗慢性粒细胞性白血病治疗候选人。
　　 3白藜芦醇诱导的自噬抑制α-MSH引起的黑色素生成[3]。自噬通过自噬小体和溶酶体的协同作用降解细胞组件和细胞器。尽管自噬主要调节细胞组件的更新，但是自噬在黑素原生成上的作用还没有得到很好的解决。在这里，我们表明， 抑制自噬会进一步抑制白藜芦醇（RSV）的抗黑素原生成的活性，白藜芦醇是一个著名的抗黑素原生成药物。白藜芦醇能够强烈地增加黑色素细胞的自噬。然而，在黑色素细胞中，ATG5的损耗显著抑制了白藜芦醇介导的黑素原生成以及白藜芦醇诱导的细胞自噬。此外，在α-MSH处理的细胞中，白藜芦醇可下调酪氨酸酶和TRP1。然而抑制ATG5恢复了酪氨酸酶和TRP1的水平。最重要的是，电子显微镜分析表明，α-MSH和白藜芦醇联合处理细胞后，自噬体吞噬了黑色素或黑素体。总的来说，这些结果表明白藜芦醇介导的自噬调节黑素原生成。
　　 4白藜芦醇抑制人鼻咽癌细胞内质网扩展和内质网天冬氨酰酶介导的凋亡[4]。自噬和内质网（ER）应激反应对肿瘤细胞保持恶性肿瘤和抵抗治疗是重要的。在人类鼻咽癌（NPC）细胞，白藜芦醇，非黄酮类药物，可以诱导细胞凋亡。在这项研究中，将探究肿瘤特异性的ER应激反应和自噬在白藜芦醇介导的细胞凋亡中的作用。透射电子显微镜（TEM）的图像表示，白藜芦醇明显增加了自噬小体的尺寸，新月形的单层膜的液泡包含多薄片状膜结构也增多。延长白藜芦醇处理时间会引起ER膨胀的大量积累。使用EGFP-LC3B转染和激光共聚焦显微镜的方法，我们发现了白藜芦醇诱导的用内质网跟踪红色色素共定位的EGFP-LC3 斑点，暗示LC3II参与了ER扩张。用ATG7的siRNA抑制自噬或用bafilomycin A1阻断自噬流，白藜芦醇的促凋亡效应被增强，但那用siRNA有针对性的沉默IRE1和CHOP后白藜芦醇的促凋亡效应没有改变。使用半胱天冬酶抑制剂，我们了证实了ucasp12的上调和casp4的激活与白藜芦醇诱导的促凋亡相关，通过caspase-9 / caspase-3途径。有趣的是，casp12的敲出，但不敲出caspase-4，减弱了NPC细胞对白藜芦醇介导的细胞凋亡的敏感性。此外，我们表明，白藜芦醇加了神经酰胺，且存在剂量依赖。使用丝氨酸棕榈先转移酶 （SPT，新创神经酰胺的生物合成的关键酶）的抑制剂（L-cycloserine和myriocin），我们发现神经酰胺积累的增加与白藜芦醇的促细胞凋亡的作用密切相关。本研究揭示了ER的扩张和ER casp12的一起上调可能表明白藜芦醇具有深远的生物效应和促进NPC细胞死亡。针对ER应激的不同状态可能会提供一个合理的癌症治疗策略。
　　 5葡萄种子提取物和白藜芦醇通过AMPK活化和相关的生物反应抑制4-硝基喹啉氧化物引起小鼠的口腔癌变[5]。对口腔癌变的预防措施是迫切需要来保证降低全球性的恶性肿瘤相关的高发病率和死亡率。在这里，我们调查了，在4-nitroquinoline-1-oxide（4NQO）引起舌头肿瘤C57BL / 6小鼠体内，葡萄籽提取物（GSE）和白藜芦醇（Res） 的化学预防疗效。用4 nqo处理老鼠8周，用ain - 76饮食或饮食含有0.2% GSE Res（w / w）或0.25%（w / w）处理随后的8周，同时用4 nqo处理老鼠。在16周终止研究，对舌头做组织结构上的评估，增生，组织发育不良，乳头状病变。然后用免疫组织化学分析分子靶点。GSE和Res喂养8周，虽然只是适度减少发病率，但明显阻止了4 nqo诱导的肿瘤出现前的肿瘤病灶的多重性和严重性，没有任何明显的毒性。在4 nqo + GSE和4 nqo + Res处理组老鼠舌组织降低了扩散 （BrdU标记指数），但增加了凋亡（TUNEL-positive细胞）相对去4 nqo组。此外，舌组织4 nqo + GSE和4 nqo + Res组显示增加了激活的代谢调控子phospho-AMPK（Thr172）和减少了自噬通流标志p62。这些发现表明，GSE和Res通过调制AMPK活化可以有效防止4 nqo诱导的口腔肿瘤发生，从而，抑制扩散和诱导凋亡和自噬。 　　 6硫代物为白藜芦醇生成提供了胞内池并引起肿瘤细胞衰老和自噬[6]。临床前研究表明植物化学分成白藜芦醇可以产生许多有益健康的好处，但白藜芦醇快速的新陈代谢和低的生物利用度可能会限制他的应用。白藜芦醇代谢物可能促进体内化合物的再生活动。我们分别用硫酸和葡糖苷酸偶联白藜芦醇来定量在人血浆和组织中的白藜芦醇。志愿者和癌症患者重复摄入白藜芦醇。随后用resveratrol-3-O-sulfate和resveratrol-4 -O-sulfate喂养小鼠，这些代谢物口服吸收，但生物利用度分别只有14%和3%。体内硫酸水解释放的自由白藜芦醇，占老鼠血浆白藜芦醇总数的约2%。单硫酸酯代谢物能也转入人类大肠细胞。细胞吸收的程度依赖于特定的膜转运蛋白和抗增殖活动决定。硫酸代谢物诱导自噬和人类肿瘤细胞衰老; 硫酸酯酶抑制剂可废除这些影响包含，并且减少细胞内白藜芦醇。综合在一起，我们的研究表明，白藜芦醇是以稳定sulfate-conjugated形式被送到目标组织和在特定的细胞中化合物是逐渐地再生和这种模式可能使白藜芦醇产生有益的影响。
　　 7白藜芦醇依赖Ca（2+）/AMPK/mTOR途径诱导人肺癌A549细胞自噬性死亡[7]。白藜芦醇有许多生物效应，包括抗肿瘤、抗病毒，和保护血管。最近的研究表明，白藜芦醇通过诱导自噬发挥抗肿瘤效应， 但是其机制还是未知的。在这项研究中，我们调查了在人类肺癌A549细胞，自噬参与白藜芦醇诱导细胞死亡过程中的作用和其潜在的分子机制。用MTT和克隆实验来分析评估白藜芦醇引起的生长抑制和细胞死亡。用自噬用磺酰尸胺，透射电子显微镜，自噬标记蛋白LC3的表达来检验自噬的激活。免疫印迹分析用于研究细胞自噬引起死亡的相关信号通路。用Fura2-AM染色检测细胞内自由钙。我们的研究结果表明，白藜芦醇诱导A549细胞死亡是由自噬介导的。自噬抑制剂3-methyladenine，抑制了白藜芦醇诱导的细胞自噬死亡。用siRNAs抑制自噬相关基因Atg5和Beclin-1 的表达，逆转了白藜芦醇诱导细胞死亡。白藜芦醇的实施立即导致细胞内自由钙的积累。自由钙的积累导致phospho-AMPK和phospho-Raptor的激活和phospho-p70S6数量的减少。AMPK抑制剂和钙离子螯合物可以逆转这些影响。总之，我们证明白藜芦醇通过Ca（2 +）/ AMPK-mTOR细胞自噬死亡信号途径，诱导A549细胞死亡。
　　 8白藜芦醇在宫颈瘤中通过凋亡和自噬引起细胞死亡[8]。宫颈肿瘤是女性最常见的癌症之一，与高危人乳头瘤病毒（HPV）感染有关。天然多酚的化学物质白藜芦醇， 基于他有可能作为化疗药物来治疗癌症已经引起了人们相当大的兴趣。这项工作中，我们在几种宫颈癌细胞系中，分析了白藜芦醇诱导细胞死亡的类型。白藜芦醇 （150 - 250年？mol / l）处理C33A（p53突变）和海拉细胞（HPV18阳性），以及在CaSki SiHa细胞系（HPV16阳性）48 h增加了停留在G1期周的细胞。Annexin-V流式细胞术分析，在所有的细胞系中，白藜芦醇诱导了细胞凋亡，，尤其是在CaSki细胞。HeLa，，CaSki，SiHa细胞线粒体膜电位下降（凋亡）和C33A，CaLo（HPV18阳性），和Hela细胞系溶酶体渗透率增加（自噬）。此外，当我们使用IC50 of each line，我们发现白藜芦醇产生了类似的效果，表明这种作用不依赖于白藜芦醇浓度。有趣的是，白藜芦醇处理后， HPV18阳性细胞系（CaLo和hela）p53的表达减少，然而HPV16阳性细胞系（CaSki和SiHa）和C33A细胞p53的表达却增加。在除了SiHa细胞系外所有细胞，p65的表达（一个NF-κB亚基）下降。这些数据表明， 在来自宫颈癌的细胞系中，白藜芦醇通过不同的机制来诱导细胞死亡。
　　 9白藜芦醇可以通过激活自噬，衰老或有丝分裂灾难导致活细胞死亡[8]。在工业化国家癌症的死亡率和发病率的最大原因。在天然产物的药物化学领域，大量研究报道反式白藜芦醇作为化学预防药物的有趣属性，能够对抗对癌症、炎症和病毒感染。肿瘤生长抑制与白藜芦醇联系在一起能够停滞细胞周期的进程和触发细胞死亡。本文综述集中阐述白藜芦醇诱导的细胞死亡的途径。白藜芦醇能够影响线粒体功能 （呼吸链、肿瘤蛋白、基因表达等），这些过程涉及到p53蛋白的磷酸化和乙酰化的形成。白藜芦醇也影响死亡受体的分布，在神经酰胺丰富的膜平台上捕获并聚集受体分子，并在细胞中促进形成死亡诱导信号复合体。对于诱导细胞凋亡，白藜芦醇能激活神经酰胺/鞘磷脂途径，促进神经酰胺的生成和下游级联激酶激活。白藜芦醇可以通过激自噬，衰老或有丝分裂灾难导致活细胞死亡等。此外，之前已有无数人尝试用白藜芦醇类似物来提高分子阻止细胞增殖和诱导细胞死亡的能力。此外， 天然酚类物质结构上的修饰有望产生有用的类似物，来研究构效关系。最后，在各种癌症类型，白藜芦醇的行为作为一个化疗增强剂降低细胞对典型的抗癌剂的死亡阈值和抵消肿瘤细胞药物抗性。
　　 10白藜芦醇在人肝癌Huh-7细胞株中引起细胞周期停滞和促进细胞凋亡[6]。白藜芦醇已被证明具有抗癌，抗衰老，抗炎，抗菌，保护神经活性。在本研究中，我们在一个新的人类肝癌细胞株丙型肝炎病毒的系统Huh-7细胞中，研究了白藜芦醇的抗增殖特性及其分子机制。结果表明，白藜芦醇显著抑制Huh-7细胞增殖（50%抑制浓度= 22.4μg /毫升）和有效地诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。它上调了p21 / WAF1 的表达，但细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A和周期蛋白依赖性激酶2的表达被抑制。白藜芦醇也增加了促凋亡/抗凋亡蛋白的比例，这与线粒体膜去极化和半胱天冬酶活性的增加有关。白藜芦醇对Fas ，Fas配体，细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和P38的表达没有影响，但减少了磷酸化ERK 和p38的表达。此外，发现白藜芦醇通过增加自噬相关蛋白Atg5，Atg7，Atg9，Atg12蛋白质，引发自噬性细胞死亡。这些结果表明，白藜芦醇可能是丙型肝炎病毒感染肝癌的重要化学预防剂。 　　 11白藜芦醇通过AMPK- 和 p62/SQSTM1依赖的自噬性的慢性粒细胞白血病细胞死亡[7]。白藜芦醇（RSV）是一个有吸引力的治疗癌症的候选人，因为它具有干预AMPK / mTOR途径各级水平的能力。事实上，RSV是独一无二的，它可以抑制mTOR和S6并且可以激活AMPK。我们的最近的数据表明，RSV引发了自噬性的细胞死亡（ACD），在慢性粒细胞性白血病（CML）细胞中，通过活化AMPK和JNK介导的 p62 / SQSTM1表达。在这里我们将讨论白藜芦醇如何调控CML细胞的ACD，也将探讨白藜芦醇通过AMPK/mTOR和 JNK/p62通路，抗CML和其他造血恶性肿瘤的可能性。
　　 12白藜芦醇引起U373神经胶质细胞瘤中自噬[6]。在真核生物中，自噬是一种细胞内蛋白质运输过程，导致细胞器和长时间使用的蛋白质降解。自噬的下调与肿瘤发展相关。这项研究调查了在人类神经胶质瘤细胞中，天然化合物白藜芦醇诱导的自噬，。神经胶质瘤细用白藜芦醇处理，对细胞生长和自噬水平进行评估。白藜芦醇抑制了U373神经胶质瘤细胞的生长和诱导细胞死亡。白藜芦醇处理后，神经胶质瘤细胞稳定表达GFP融合LC3，细胞产生了更多GFP-LC3-labeled自噬小体，含有GFP-LC3-labeled自噬小体细胞的百分比增加。此外，在白藜芦醇处理的神经胶质瘤细胞种， 用P38或ERK1/2抑制剂预处理，减少了自噬水平，这表明白藜芦醇诱导的自噬被P38和ERK1/2途径调控。Akt/ mTOR途径与白藜芦醇诱导的自噬无关。我们的研究结果表明， 通过诱导自噬白，藜芦醇对神经胶质瘤细胞具有抗癌效果。
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