支原体dna检测pcr|干细胞中支原体PCR检测方法的建立

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　　摘要：目的：为了更好的检测干细胞中支原体污染的情况。方法：以本实验室2013年12月-2014年4月间培养的干细胞56份为研究对象，使用PCR方法对干细胞中的支原体污染情况进行检测，并使用支原体检测试剂盒进行对比检测，统计检测干细胞中支原体污染的情况及种类。比较PCR检测方法与支原体检测试剂盒的准确性及特异性。结果： PCR检测阳性例数为21例，试剂盒检测阳性例数为12例，而阳性率分别为37.5%和21.4%。两组间阳性例数和阳性率比较结果差异显著（p0.05）。结论：PCR检测方法较支原体试剂盒检测方法具有更高的准确率和敏感性。

　　关键词：支原体；干细胞；PCR检测
　　【中图分类号】
　　R249 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）07-0029-01
　　近些年，干细胞对治疗如糖尿病、神经退行性疾病及骨关节疾病等疾病均有良好的应用评价，并且很多研究人员和普通人希望干细胞能在更多的疾病治疗领域发挥更为广阔的应用价值。人胚胎干细胞（hESCs， human embryonic stem cells）因其具有无限增殖能力和多向分化潜能而被作为研究干细胞的常用细胞类型[1，2]。细胞出现支原体污染是实验室中比较常见的现象，感染率一般为5-30%[3]。有研究人员的研究结果显示，支原体污染概率与细胞传代次数呈现正相关性。本研究对干细胞感染支原体的情况进行PCR检测，并使用支原体检测试剂盒进行对比检测。
　　1 材料与方法
　　1.1 所需试剂：
　　PCR 预混料（购买自上海生工）；DL2000 DNAMarker（购买自北京天根生物）；琼脂糖为BD公司；支原体检测试剂盒（美国Lonza公司）；琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物（购买自美国Promega公司）；其他试剂均为分析纯。
　　1.2 主要仪器：
　　PCR扩增仪（购买自美国Biometra公司）；超低温冰箱、恒温CO2培养箱、高速低温离心机（购买自德国Thermo公司）；电子分析天平（购买自上海分析仪器厂）；超纯水仪（购买自美国Millipore公司）；DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪（购买自北京六一仪器厂）；凝胶成像分析系统（购买自美国Bio-RAD公司）；超净工作台（购买自苏州净化设备公司）。
　　1.3 引物设计：
　　根据GenBank 收录的支原体 Ala-PG8株、Ora-CH19299 株、Mho- BTS7株、Arg-G230 株、Fer-PG18株的序列，使用Primer5.0软件设计引物，设计出的引物是可以扩增出以上5株支原体序列的通用引物。引物序列如下：
　　上游引物5’-CCAGCAGCCGCGGTATACATA- 3’
　　下游引物5’-GTGGACTACTAGGGTATCTAAT- 3’
　　1.4 干细胞的培养
　　1.4.1 Feeder的培养：
　　将本实验室培养后冻存的人成纤维细胞进行复苏，然后在培养皿中放置在CO2培养箱中培养，培养12h后在培养液中加入浓度为10ug/ml的丝裂霉素C，共同培养2.5h。然后使用胰酶消化人成纤维细胞加入到6孔板中，这样就形成了Feeder。
　　1.4.2 干细胞的培养：
　　将本实验室培养后冻存的人胚胎干细胞进行复苏，共分7次复苏，每次2份细胞，并且在培养24、48、72、144小时之后取细胞样品进行PCR检测，共计复苏56次不同冻存批次和代数的人胚胎干细胞。将Feeder中的培养基换为人胚胎干细胞培养基，复苏之后将细胞加入到Feeder之上，放置在4个不同的CO2培养箱中的不同位置进行培养。
　　1.4.3 PCR检测：
　　在培养24、48、72、144小时之后取细胞样品进行PCR检测，首先使用移液器将培养人胚胎干细胞的6孔板中的培养基吸除，使用PBS溶液清洗一次，使用胰酶将人胚胎干细胞消化下来，使用移液器将收集的人胚胎干细胞以2500rpm离心10min，然后使用500ul 的PBS溶液重悬细胞。放置在100水浴锅中煮沸10min，以细胞悬液10ul为模板，进行PCR扩增，扩增体系和条件见表1和表2。
　　PCR扩增之后，对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳之后在凝胶成像仪下观察并保存结果。扩增出条带大小符合支原体DNA的为支原体污染样品，如果没有符合的条带，则视为没有支原体污染。
　　1.4.4 支原体试剂盒检测： 取出1管Lonza支原体检测瓶，在无菌超净台内将培养好的干细胞培养液加入到支原体检测瓶中，盖好检测瓶的盖子，放入37℃水浴锅中1h，观察检测结果。
　　1.5 数据统计： 将所有获得的结果使用SPSS19.0软件进行统计，两组之间比较采用卡方检验，当p0.05）。详细结果见表4。 　　3 讨论
　　一般在细胞培养的过程中，支原体污染的情况不容易被发现，因为支原体不像细菌污染一样可以在显微镜下或肉眼进行观察。但是支原体污染后会对细胞的生长，以及细胞内的基因表达及蛋白合成等反面均造成一定影响，这样就会对科研研究结果造成一定影响[4]。以前常用的方法是采用琼脂培养检测支原体，通过观察支原体的生长特征来判断细胞在培养过程中是否出现支原体污染的情况[5]。但是这种经典的方法所需的时间较长。对细胞培养过程中支原体污染检测的方法还有使用电镜检测、荧光染色、双酶分析法等，但这些方法的灵敏性较低，并且操作比较复杂，检测需要较高的费用。而PCR检测支原体方法是近几年得到应用的新检测方法，PCR检测操作简单，所需时间较短，并且具有很高的灵敏性。
　　本研究中，使用PCR检测干细胞中支原体污染情况比实验试剂盒检测的灵敏度高。并且检测结果显示，培养的时间越长，支原体污染的几率越大。所以在干细胞培养过程中，应该对长期培养的干细胞进行相应的处理，以防支原体污染。PCR方法可以很好的检测干细胞中支原体的存在情况。
　　对出现支原体污染的细胞的处理方法方法并不是很多，并不像临床上治疗支原体的方法丰富多样[6，7]。所以在细胞培养过程中应该时刻注意支原体污染的情况。如果胚胎干细胞出现支原体污染的情况，使用抗支原体的药物对胚胎干细胞处理之后，对支原体的生长短时间内具有很好的控制作用，但是并不能将胚胎干细胞中支原体完全清除。并且出现支原体污染的胚胎干细胞会对细胞培养室内其他细胞株造成交叉感染，如果没有更好的处理办法，建议将出现支原体污染的胚胎干细胞进行妥善处理或者直接丢弃。
　　参考文献
　　[1] Lin HT， Otsu M， Nakauchi H. Stem cell therapy： an exercise in patience and prudence [J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci， 2013， 368（1609）：1-6.
　　[2] Mengarelli I， Barberi T. Derivation of multiple cranial tissues and isolation of lens epithelium-like cells from human embryonic stem cells [J]. Stem Cells Transl Med， 2013， 2（2）：94-106.
　　[3] Uphoff CC， Denkmann SA， Drexler HG. Treatment of mycoplasma contamination in cell cultures with Plasmocin [J]. J Biomed Biotechnol， 2012， 2012：1-8.
　　[4] Markoullis K， Bulian D， Holzlwimmer G， et al. Mycoplasma contamination of murine embryonic stem cells affects cell parameters， germline transmission and chimeric progeny [J]. Transgenic Res， 2009， 18（1）： 71- 87.
　　[5] 孙雪荣，王卫鸿，陈嘉等. Plasmocin对人胚胎干细胞支原体污染的杀灭效果[J]. 中国热带医学，2013，13（7）：783- 785.
　　[6] Paessler， M.， A. Levinson， et al. Disseminated Mycoplasma orale infection in a patient with common variable immunodeficiency syndrome[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 200244（2）： 201-4
　　[7] Wei， W. Continuous versus intermittent azithromycin administration for treatment of Mycoplasma pneumonia-induced pneumonia： effects and drug resistance in rats [J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao 2008，30（8）： 1918-9， 1922

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